痴迷系列 冲破空间组学策动极限：Visium HD 与 Xenium In Situ 的齐全交融

新式的空间转录组学器用将传统成像与分子分析如胶似漆，让您更全面地了解感深嗜的生物学特征。不管您是揭示神经系统复杂性的神经科学家，如故长远知道肿瘤微环境的振荡策动东说念主员，抑或是尝试讨教各种其他问题的科学家，空间维度的视力王人能为您的策动名堂掀开新的大门。辩论到这些方法的远景和日益增多的应用痴迷系列，如今的问题也曾从“我为什么要策动空间生物学”袭击为“我想通过空间生物学竣事什么，以及我该怎么作念？”

为了让您省略提议我方想问的问题，咱们勾引出两种互补的空间转录组学方法：基于NGS的全转录组Visium空间基因抒发分析和基于靶向成像的Xenium原位分析。哪一种最相宜您刻下的应用，或者是否应该同期使用，这个问题的谜底取决于您的策动名堂、方向和骨子辩论。

咱们制作了这份指南，匡助您熟谙咱们的Visium HD和Xenium时期，同期胪陈了将空间转录组学纳入策动时的紧迫主见。

互补的空间器用：

Visium HD和Xenium原位分析

在试图发现新的靶点或等闲表征感深嗜的组织时，Visium HD空间基因抒发带来的全转录组分析是一种巨大的器用。Visium HD是一种基于测序的空间转录组学分析，它接纳基于探针的化学方法进行空间布景下的全转录组分析。将探针与靶点杂交，再与步调载玻片上的组织相汇注。洗掉未团结的探针，然后通过CytAssist将团结的探针精准搬动到Visium HD玻片上（这个要道设施可通过最大限制减少扩散来扶持空间保真度）。然后行使这些探针生成带有空间条形码的NGS文库，以便生成测序读数（对于Visium HD的职责旨趣，参考资源3中有更详备的证据注解。）

若是您需要精准了解感深嗜的基因，Xenium原位分析则提供了纳米级的分辨率，可检测整张组织切片上单个细胞内的数百个基因（不久后将达到5，000个）。Xenium是一种基于成像的空间转录组学分析，使用了靶向预选基因的锁式探针。与方向基因杂交后，探针通过汇注而环化（为靶点特异性增添了一层真实度），并在滚环响应中扩增。之后在Xenium分析仪上，通过多轮荧光探针杂交、组织成像和探针去除对扩增产品进行检测，产生基于成像的读数。（对于Xenium的职责旨趣，参考资源4里有更详备的证据注解。）

终末，必须指出的是，Visium HD和Xenium并不是“非此即彼”，而是相反相成，为您提供最显著的生物学图像。举例，您不错使用Visium HD来建筑健康或疾病景况下的组织空间图谱，然后接纳为谋端正制的Xenium基因组合进行更精细的分析。Ayako Suzuki博士恰是这样作念的。左证她最近发表在《Nature Communications》上的文献（5），她率先使用Visium v2来细目肺部肿瘤中的基因抒发变化发生在哪些位置，然后用Xenium来放大，精细目位与肿瘤亚型中的肺泡塌陷联系的特定细胞和细胞类型。

时期规格比较

对于多重分析：

全转录组、靶向分析和定制选项

多重分析：单次分析可测定若干种RNA（基因、外源基因、同源异构体等）。

每个平台达到的转录本遮掩广度和深度各不沟通。为了提供等闲的遮掩，Visium HD省略无偏地遮掩统共转录组（约20，000个基因）。再团结为其他感深嗜的靶点想象定制探针的才调，Visium HD具有无以伦比的空间发现才调，省略表征等闲的组织，从新遒劲感深嗜的区域或细胞类型。

同期，Xenium通过多达480个基因的基因组合带来了靶向分析功能（2024年行将推出的Xenium 5K东说念主类和小鼠基因组合将延迟到5，000个基因）。这些预想象的基因组合有多种成立，带有组织或应用特异性的靶点，最多可定制添加100个方向基因。此外，您也不错想象孤独的定制480重基因组合，而高档定制想象选项还将助力您检测外源基因和感深嗜基因的异构体。若是您知说念我方想检测什么（并但愿长远良好不雅察），那么Xenium将是无可匹敌的。

多重分析比较

查找Visium HD定制探针的联系资源（1）。

表征机灵度：

单基因机灵度、基因检测范围和转录本丰采

机灵度：界说检测转录本的遵循如何。尽管在空间时期领域被等闲使用，但不错细分为：单基因机灵度、基因检测范围和转录本丰采。使用哪个术语取决于作家想要强调哪个具体方面的性能。

单基因检测机灵度

分析省略检测到的每个基因的转录本数目。这个主见在分析各别基因抒发和检测选藏转录本、同源异构体和基因变异等应用中至关紧迫。再团结基因检测范围（见下文），这个主见有助于细目分析的动态范围。

基因检测范围

您省略在每个细胞或组织区域内检测到若干种不同的转录本，具体取决于单基因机灵度、多重分析和组织类型。在以发现为要点的应用中，基因检测范围绝顶紧迫，举例表征健康或疾病景况下的感深嗜组织。

转录本丰采

每个细胞或组织区域内可检测到的转录本总和。这个主见可用来细目举座基因抒发的大范围变化。左证分析方法的单基因机灵度、基因检测范围、多重分析以及分析的组织总面积盘算得出。

那么Xenium和Visium的机灵度比拟之下如何呢？尽管Xenium和Visium HD的径直比较数据正在生成当中，但咱们最近在《Nature Communications》杂志上发表了一篇论文（2），对Xenium和“步调显著度的”Visium v2在一语气组织切片上的机灵度进行了比较。

在这个特定推行和样本中，Xenium的单基因机灵度高于Visium v2，而Visium v2的基因检测范围和转录本丰采均高于Xenium。这在很大程度上是由于Visium拿获了统共转录组数据，而Xenium则接纳了愈加靶向的方法。此外，咱们还珍视到，在某些组织类型（但不是一说念）中，以高于咱们保举的深度进行测序会导致单基因机灵度显赫升高。因此，在某些组织或样本中，转录本丰采和单基因机灵度会跟着测序深度而有所诊治。

机灵度比较

*珍视：这次比较的闭幕来自单次推行（2），它接纳Visium v2来分析一种样本类型；其他数据比较（包括Visium HD数据）行将发布。

聘用分辨率：

如何分拨转录本以及如何精细地分拨？

分辨率：包括将转录天职拨到界说的组织区域或细胞中的哪个位置，以及不雅察它们的最精细程度。

Visium HD中的转录本被分拨到一个小到足以拿获单细胞的区域。具体来说，行使CytAssist仪器将团结的探针精准搬动至拿获区域，其中寡核苷酸一语气成列在数百万个2 x 2 µm条形码象征的正方形中。然后以2 x 2 µm正方形单元以及多个合并单元输出这种基于空间条形码的测序读数（包括8 x 8 µm合并单元，这是咱们保举的分析起初）（图1A）。

由于这些正方形单元小到足以拿获单细胞，这种方法能表征每个单元中存在的主要细胞类型。辩论到这种合并战术和真核细胞的平均大小（介于10到100 µm），每个合并区域可能遮掩不啻一个细胞的组分；因此，Visium HD带来了咱们所说的单细胞分辨率（图1B）。第三方器用可匡助您对Visium HD数据进行数据点解卷积。

图1A. Visium HD的拿获区域结构。这张暴露图展示了Visium HD玻片的布局，带有两个6.5 x 6.5 mm的Visium HD拿获区域，其中拿获寡核苷酸一语气成列在细分为2 x 2 µm的正方形单元内。

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图1B. 对H&E染色后的东说念主类结肠癌组织的Visium HD分析，转录本被分拨到8 x 8 µm的合并单元内。图中展示了带有无监督基因抒发聚类的东说念主类结肠癌减弱图像（左图），以及8 x 8 µm单元内的基因抒发聚类放大图像（右上图）和H&E染色组织放大图像（右下图）。Visium HD省略分辨2 x 2 µm正方形内的转录本，但咱们建议以8 x 8 µm的合并单元行动起初进行可视化和分析。

Xenium原位分析将转录天职拨到单个细胞中（图2）。在Xenium运行过程中，组织中的每条转录本会被分拨X-Y-Z轴坐标。之后，在仪器运行过程中进行多模态细胞分割，行使各种形态学染料和专门的东说念主工智能算法来细目各个细胞的畛域。左证这些畛域偏执空间坐标将每条转录天职拨给单个细胞，精度达到纳米级（XY轴定位精度 < 30 nm，Z轴定位精度 < 100 nm）。

图2. 行使Xenium Explorer对东说念主类肺腺癌进行分析。上图显现的是东说念主类肺腺癌切片的图像，下图显现了Xenium Explorer放大后的图像，图中展示了分割的细胞以及定位在单个细胞内的与免疫细胞类型联系的采选转录本。

分辨率比较

卓绝基因抒发：

行使多组学功能取得更多信息

多组学分析：除了RNA除外，您不错测定的全套分析物，比如形态、卵白质等。

Visium HD和Xenium王人能评估合并张切片的形态（H&E染色）、卵白质（免疫荧光IF染色）和RNA数据。在撰写本文时，Visium HD可在单张切片上进行H&E或IF染色，而Xenium可进行两种染色。

对于Visium HD分析，H&E或IF染色是在职责经由运转前进行的，这让您省略在Visium经由之前行使成像数据筛选组织切片。对于Xenium，H&E和IF染色在Xenium职责经由闭幕后进行。客户还不错行使Xenium化学方法的非落魄性特色，在Xenium经由闭幕后对合并张切片进行Visium分析（咱们正在定量Xenium分析对Visium HD的分析性能有何影响，若是有的话）。终末，咱们展望在2024年晚些时候推出适用于Xenium平台的< 30重集成卵白质组学处理决议。

** Visium HD测试正在进行中，咱们很快会有更多的数据。

从表面想考到骨子问题：

组织类型、样本神气和经费考量等

在试图将新时期整合到您的推行室中时，实用性是要道的身分。在这一部分，咱们将分析一些紧迫的辩论身分，如组织类型、样本神气、数据分析方法和仪器使用。

组织固定、兼容物种和组织神气

组织是统共推行的基础，而两个身分将决定分析的程度——组织是否固定以及它开头于哪个物种。

Xenium和Visium HD分析王人与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织兼容，而Xenium还与崭新冷冻组织兼容。咱们盘算在近期发布一套行使Visium HD分析崭新冷冻组织的示范决议。

在物种兼容性方面，Visium HD不错对东说念主类和小鼠进行全转录组分析。若是您有利向分析非东说念主类灵长动物或大鼠组织，请发邮件至support@10xgenomics.com，咱们也许能提供您的物种与东说念主类和小鼠探针组的同源性讲述。对于Xenium分析，咱们提供了东说念主类和小鼠的预想象且可定制的基因组合。此外，Xenium分析也兼容其他物种，您不错通过高档定制想象经由（6）来创建基因组合，分析带有转录组注视的任何物种。

组织神气亦然一个紧迫的辩论身分。Visium CytAssist仪器允许您使用归档或事先切片的载玻片，以及从FFPE组织块中专门崭新制备的载玻片。Xenium则条目在Xenium载玻片上径直进行组织切片。

划要点

若是您的组织是FFPE组织，开头于东说念主类或小鼠，那么与任一平台兼容。Xenium分析也与崭新冷冻组织兼容，在行将发布的示范决议中，这一功能将延迟到Visium HD。若是您策动的物种既非东说念主类又非小鼠，Xenium可通过高档定制想象选项与任何物种兼容，而Visium HD可能与非东说念主类灵长动物或大鼠兼容（取决于客户撑握指南）。

样本数目、组织大小和时辰罢休

对于任何时期而言，样本越多，耗时越长。然则，这一无边端正有两个主要离别。

率先，突出消耗的时辰并不一定因每个突出样本呈线性增多。其次，组织样本在拿获区（Visium HD）或成像区（Xenium）的成列方式多各种种——一张载玻片不错容纳一个大样本、几个中等样本或多个小样本（图3）。

辩论到这一离别，从运行的玻片数目（而非严格深嗜上的分析样本数）来辩论这些时期可能会有所匡助。

图3. Visium HD和Xenium载玻片上的组织甩掉方式示例。Visium HD（上图）或Xenium（下图）的单次运行可左证各种不同的组织成立来优化，包括（但不限于）单块大切片和组织芯片，具体取决于推行的需求。

行动一种基于NGS的时期，每次Visium HD运行的输出闭幕是一个测小序库。这样您就能在单次NGS运行中批量处理大王人样本。因此，在Visium分析时，您省略通过批量处理大王人样本的测小序库来扩大鸿沟。Visium HD职责经由本人大致需要2-3天，其中手动操作约8小时，况兼可左证样本、东说念主员、热轮回仪和CytAssist仪器的可用性进行并行处理。

Xenium是一种基于成像的时期，而单细胞空间成像推行中最耗时的部分即是成像。尽管咱们也曾逸以待劳来优化这些设施，但每次Xenium运行王人需要我方的图像网罗和分析，这与基于NGS的Visium HD职责经由中的测序设施最为相同。

对基于成像的Xenium来说，组织分析时辰和通量随分析的组织总面积和分析多重性而定。在行使480重基因组合分析总面积为4 cm2 的组织（使用多模态细胞分割）时，咱们展望手动操作时辰为6小时，图像网罗前的准备时辰为2-3天，这些操作可并行开展，取决于样本、东说念主员和扩增仪器的可用性。基于这些参数，图像网罗和分析可能需要长达3天的时辰，不外您不错聘用分析组织上的部分区域来裁汰运行时辰。

划要点

咱们建议您估算每个组织样本的大小，以此来细目每种时期需要运行的玻片总和，并细目大致的分析总时辰。

数据分析方法

Xenium原位分析和Visium HD分析的数据最终诀别以基于成像和测序的神气输出。两个平台王人提供了直不雅的数据可视化和分析经由，并与第三方器用节略兼容，让您省略充分行使数据。

在Visium文库测序完成后，通过Space Ranger分析经由运行数据。这些输出闭幕（包括但不限于特征条形码矩阵（h5）和组织位置（parquet）等文献方法）可通过Loupe Browser进行可视化，并对Visium聚类进行各别分析和再聚类（图4）。

图4. Loupe Browser中的Visium HD数据可视化示例。可视化闭幕呈现了E17小鼠胚胎中转录本的抒发散播。

Xenium数据的机载分析与图像网罗和分析设施同步进行，因此在运行闭幕后会立即生成可证据注解的数据，具身神气包括ome.tiff（图像）、.parquet、.zarr和.csv（转录本）。这些输出闭幕可通过Xenium Explorer进行可视化（图5）。

图5. Xenium Explorer中的Xenium数据可视化范例。可视化闭幕呈现了行使Xenium东说念主类多种组织和癌症基因组合分析的FFPE东说念主类肺癌组织。

咱们深知一些使用案例也很紧迫，但超出了咱们提供的软件处理决议的范围，因此咱们确保这两个平台王人能以多种常见的开源文献方法提供数据输出，便捷使用第三方器用进行分析。咱们的Visium（7）和Xenium分析指南（8）中列举了现在可用的第三方器用。

划要点

Xenium和Visium HD王人独到全面整合且直不雅的数据可视化和分析经由、多种洞开方法的文献输出以及与第三方分析器用的节略兼容。

向空间分析迈出下一步

这两种时期王人能让您夙昔所未有的显著度、深度和广度来不雅察组织。咱们将要点细致在本篇著述中，但愿能匡助您长远了解每种方法的上风。迎接跳转到Visium HD（9）和Xenium页面（10），了解更多信息！

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参考资源：

https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression-flex/documentation/steps/experimental-design-and-planning/custom-probe-design-for-visium-spatial-gene-expression-and-chromium-single-cell-gene-expression-flex

https://www.nature.com/articles/s41467-023-43458-x

https://www.10xgenomics.com/cn/products/visium-hd-spatial-gene-expression

https://www.10xgenomics.com/in-situ-technology#how-it-works

https://www.nature.com/articles/s41467-023-43732-y

https://www.10xgenomics.com/support/in-situ-gene-expression/documentation/steps/panel-design/species-standalone-custom-and-advanced-custom-panel-design-for-xenium-in-situ

https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/continuing-your-journey-after-running-space-ranger

https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/continuing-your-journey-after-xenium-analyzer

https://www.10xgenomics.com/cn/products/visium-hd-spatial-gene-expression

https://www.10xgenomics.com/cn/platforms/xenium

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